Anh sinh ra ở Memphis, Tennessee. Bố là Randall Timberlake và mẹ là Lynn nee Bomar. Cha mẹ Justin ly hôn vào khoảng năm 1985 và cả hai đều đã tái hôn. Bà Bomar hiện đang điều hành công ty JustinTime Entertainment đã tái hôn với Paul Harless, một ông chủ nhà băng. Khi Justin 5 tuổi thì bố anh đã co 2 đứa con với người vợ thứ hai - Lisa. Một người em của Justin mất vào năm 1997 và được đề cập đến trong bài "My Angel in Heaven".

Justin Timberlake lớn lên ở Millington một thị trấn nhỏ phía Bắc Memphis. Năm 1993, Justin bắt đầu nổi tiếng khi tham gia vào hàng ngũ của Mickey Mouse Club. Club này còn có sự tham gia của Christina Aguilera, Britney Spears, Ryan Gosling và JC Chasez (thành viên ban nhạc *NSYNC sau này). Sau khi show này kết thúc, Justin cùng người bạn JC, Lou Pearlman, Chris Kirkpatrick thành lập nhóm nhạc 'NSYNC.

Phong cách hát và điệu nhảy của Justin có phần ảnh hưởng từ thần tượng là Michael Jackson.